因实验需要提取质粒2mg左右，请问哪家的大体试剂盒可用，价格如何？建议碱裂解法，土法提质粒总比盒子质好量多。呵呵………… Promage和Quigen有大提的盒子，我也用过，不过还是嫌少。 土法操作我们一般400ml菌液可以提10-20mg,纯度可达到98%. 盒子绝不可能，那得多大的吸附柱呀，Quigen有5mg量的，5次/包装，每次价格1000多元，endotoxin free，速度慢，需要一整天时间。 eeflying兄说的有道理，如果不是特别的试验，建议采用手工方法，我们用这种方法提的质粒免疫动物没有问题。 下列方法是我优化过的，不同与“分子克隆”的方法，曾用于制备DNA疫苗。 质粒DNA的大量制备 1）挑取一个新鲜菌落接种于含5ml LB及相应抗生素的试管，37℃培养8-12小时。 2）用上述新鲜培养物小提质粒鉴定后，剩余的菌液接种于含相应抗生素的400ml LB培养基中，37℃培养12-16小时。 3）用500ml离心筒收集菌液，5000rpm离心10分钟，弃上清。 4）用40ml预冷的STE重悬菌体，转移至2支30ml离心管中，6000rpm 5分钟，弃上清。 5）用3ml预冷的溶液I重悬菌体，再加入6ml新鲜配制的溶液II，轻轻颠倒混匀；再加入4.5ml预冷的溶液III，轻轻颠倒混匀。 6）4℃ 12000rpm离心10分钟，将上清转移至另外的30ml管中。 7）加等体积的异丙醇，颠倒混匀，置于－20℃ 20分钟以上。 8）4℃ 12000rpm离心15分钟，弃上清，70％乙醇洗涤沉淀，37℃蒸发至沉淀边缘透明。 9）加入5ml TE使DNA溶解后，加入5mol/L的LiCl溶液5ml，轻轻混匀，-20℃放置5-10分钟。 10）4℃ 12000rpm离心15分钟，转移上清，加入等体积的异丙醇，-20℃放置20分钟以上。 11)4℃ 12000rpm离心15分钟，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀，倒置控干后，37℃蒸发至沉淀基本透明。 12）用2ml TE溶解沉淀，并加入50μl/管的RNase（5mg/ml），37℃消化过夜。 13）分装质粒DNA至1.5ml微量离心管中，加入等体积的酚－氯仿，混匀后12000rpm离心5分钟，转移上层水相至另外的微量离心管中。 14）重复步骤13）一次。 15）加入1/10体积的3mol/L的NaAc（pH5.2）和2倍体积的无水乙醇，-20℃放置20分钟以上。 16）12000rpm离心15分钟，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀，弃乙醇后，37℃干燥至沉淀基本透明。 17）将质粒DNA以干燥的沉淀形式保存于-20℃，使用前按需要溶解DNA。我出个新鲜的。 来源暂且保密，我只说做法，大家试试，好就说一声。 Yong主任的11) 12). 5mlTE溶解。 13).5ml 10mM Tris-Hcl PH:7.9 14). 加精氨酸(Spermine-Hcl)至1.5mM,冰上静置 15).4C离心10000gX10min 16).用溶液溶解。看你后续试验的要求决定用什么溶解。 老外给的Protocol，据说马上就要就发表的新方法 反正我以前没见过这么做的，用精氨酸沉淀质粒， 不知别人见过吗？ 我没试过，他说可以完全除去内毒素。QIAGEN www.giagen.com EndoFree plasmid kit或Plasmid kit （Giga,10mg/柱X5；Mega,2.5mg/柱X25或X5；Maxi,0.5mg/柱X10,25,100) 人民币：不到6000元 基因公司代理eeflying wrote: 我出个新鲜的。 来源暂且保密，我只说做法，大家试试，好就说一声。 Yong主任的11) 12). 5mlTE溶解。 13).5ml 10mM Tris-Hcl PH:7.9 14). 加精氨酸(Spermine-Hcl)至1.5mM,冰上静置 15).4C离心10000gX10min 16).用溶液溶解。看你后续试验的要求决定用什么溶解。 老外给的Protocol，据说马上就要就发表的新方法 反正我以前没见过这么做的，用精氨酸沉淀质粒， 不知别人见过吗？ 我没试过，他说可以完全除去内毒素。 确实新，值得一试，看看这种方法选择性沉淀质粒DNA的能力，蛋白能否除干净。如果内毒素可以除干净，加5分都不过分。 先加分再说老兄们哪找的这么高的洋大仙。意大利，呵呵看了Yong主任和eeflying 兄的经验之谈,让我们这些新手节省了很多时间,谢谢! 对于eeflying 兄所介绍的方法有机会我会试试,如果正能去除内毒素就太好了。 也请eeflying 兄在适当的时候告诉出处，这样也让我们可以有章可循了。再者请已使用了此方法的同道来此通告一声。 我想请问，验证质粒是否有内毒素有什么方法吗？本来来源于私人通信，所以没法提供出处、、他说最近要发表，可还没告诉我发哪里了，回头我问问他。 内毒素一般用鲎试剂呀，很经典的，晶美目录上就有。谢谢eeflying兄！谢谢eeflying 的大作！ 我又长见识了！7) 0.7volume of isopropanol was added,followed by incubating in room temperature for at least 30min. 8)centrifuge and dissolve in TE. 9)put 2.5 volume of 4M LiCL in TE,and incubate on ice for 10 min. 10)centrifuge ,then and RNase to supernant and then extract with chorfm-phenol. 11)add 0.5 volume of 20% PEG8000(CONTAINING 2.4M NaCL) and centrifuge . 12)redisolve pellet in TEeeflying所提的方法第14步，应在冰上静置多久？ 用这些方法提的质粒用来转染细胞应该没问题吧？ 因本人技术比较差，用qiagen endofree plasmid maxi kit提的质粒产量很低，哪位同仁做过？产量如何？我仔细地看了handbook，该注意的都注意了，可实际所得与应得量还是相差太远。抑郁中........ffray wrote: eeflying所提的方法第14步，应在冰上静置多久？ 用这些方法提的质粒用来转染细胞应该没问题吧？ 一般15-30分钟吧，无所谓，我们一般都是玩一会， 转细胞没问题。哈哈，分子生物学越做越象炒菜要象炒菜那样容易就好了。我很赞同经典的提取方法，比试剂盒好，虽然有时会麻烦点，但很好用的。 用碱裂解法提取，确实很管用。weiyutuo wrote: 我很赞同经典的提取方法，比试剂盒好，虽然有时会麻烦点，但很好用的。 用碱裂解法提取，确实很管用。 试剂盒本来就是碱裂解法，只不过再加了一个层析柱而已，并因其而高质量。 离子交换层析+沉淀yong 下列方法是我优化过的，不同与“分子克隆”的方法，曾用于制备DNA疫苗。 eeflying wrote: 我出个新鲜的。 High, very high! higher hand out of high hand. ^_^eeflying 一般15-30分钟吧，无所谓，我们一般都是玩一会， CÖÖL! very cool!精氨确实可以沉淀DNA，但比较少用，对昂贵的DNA会有人用。质粒没有必要用吧！！ 在卢圣栋主编的现代分子生物学实验技术里，旧板的56页，新板的不知道多少页，介绍了精氨沉淀DNA。 可以看看，我没有扫描的，贴不出来。我试过了，鲎试剂检测阴性， 可以无限扩大规模，比Quiagen盒子合算多了。 作疫苗没问题。真核表达比PEG效果好。 主任可说过要能除内毒素，加五分， 不知主任试过没有，要不俺赠一份鲎试剂给你。呵呵………………先欠你两分！ 待俺试过后再补！ 顺便问一句，质粒的得率和超螺旋结构没问题吧？Yong wrote: 先欠你两分！ 待俺试过后再补！ 顺便问一句，质粒的得率和超螺旋结构没问题吧？ 这两分不能要，我是玩笑话， 还请收回。 呵呵，我实在是不缺分数了。 质粒的得率不如聚乙二醇高，不过过得去， 反正是细菌繁殖又不用我操心， 扩大系统呗。从理论上讲，这个系统可以无限扩大。 超螺旋没验证，不过应该比柱子对质粒的破坏小， 转染是否超螺旋没关系， 因为线性化的质粒本来转染率就高嘛。感谢eeflying提供的信息 这种方法的文章已经发表了！ 1: J Immunol Methods 2003 Mar 1;274(1-2):257-64 Related Articles, Links Spermine compaction is an efficient and economical method of producing vaccination-grade DNA. Mourich DV, Munks MW, Murphy JC, Willson RC, Hill AB. Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health Sciences University, Portland, OR, USA. [email protected] Plasmid DNA inoculations can induce both humoral and cellular immunity, and this technique is now being employed in developing vaccination regimens for a large number of applications. DNA vaccination studies require the preparation of large amounts of purified plasmid DNA with low endotoxin contamination, and the cost burden for multiple injections, multiple animal or large animal studies is significant. We recently reported that selective compaction with spermine can be used to purify large quantities of DNA. We wanted to determine whether this method would produce DNA suitable for vaccination. Endotoxin levels for spermine-compacted DNA were 0.3+/-0.01 endotoxin units (EU)/microg, well within the accepted range (less than 3 EU/microg) for in vivo use. When injected intramuscularly into mice, column-purified and spermine-compacted DNA induced an equivalent antigen-specific CD8+ T-cell response. The labor and time involved in purifying 5 mg of DNA by each method were similar, but the cost of spermine-compacted DNA was only 20% of the cost of column-purified DNA. We conclude that spermine compaction is an efficient and economical method for preparing vaccination-grade DNA. Publication Types: Evaluation Studies PMID: 12609551 [PubMed - indexed for MEDLINE] 附件挂不上，如果要原文可以留下Email  感谢eeflying提供的信息 这种方法的文章已经发表了！ 1: J Immunol Methods 2003 Mar 1;274(1-2):257-64 Related Articles, Links Spermine compaction is an efficient and economical method of producing vaccination-grade DNA. Mourich DV, Munks MW, Murphy JC, Willson RC, Hill AB. Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health Sciences University, Portland, OR, USA. [email protected] Plasmid DNA inoculations can induce both humoral and cellular immunity, and this technique is now being employed in developing vaccination regimens for a large number of applications. DNA vaccination studies require the preparation of large amounts of purified plasmid DNA with low endotoxin contamination, and the cost burden for multiple injections, multiple animal or large animal studies is significant. We recently reported that selective compaction with spermine can be used to purify large quantities of DNA. We wanted to determine whether this method would produce DNA suitable for vaccination. Endotoxin levels for spermine-compacted DNA were 0.3+/-0.01 endotoxin units (EU)/microg, well within the accepted range (less than 3 EU/microg) for in vivo use. When injected intramuscularly into mice, column-purified and spermine-compacted DNA induced an equivalent antigen-specific CD8+ T-cell response. The labor and time involved in purifying 5 mg of DNA by each method were similar, but the cost of spermine-compacted DNA was only 20% of the cost of column-purified DNA. We conclude that spermine compaction is an efficient and economical method for preparing vaccination-grade DNA. Publication Types: Evaluation Studies PMID: 12609551 [PubMed - indexed for MEDLINE] 附件挂不上，如果要原文可以留下Email 我是新手，我想要原文！谢谢 [email protected] 不会很大吧？发出，收到回复。eeflying wrote: Yong wrote: 先欠你两分！ 待俺试过后再补！ 顺便问一句，质粒的得率和超螺旋结构没问题吧？ 这两分不能要，我是玩笑话， 还请收回。 呵呵，我实在是不缺分数了。 质粒的得率不如聚乙二醇高，不过过得去， 反正是细菌繁殖又不用我操心， 扩大系统呗。从理论上讲，这个系统可以无限扩大。 超螺旋没验证，不过应该比柱子对质粒的破坏小， 转染是否超螺旋没关系， 因为线性化的质粒本来转染率就高嘛。 真的是线性化的质粒转化率高么？ 我想知道为什么？ 因为我一直觉得线性的低很多，还用次来教育别人，真是很惭愧哎呀！ 请多多指教！收到，谢谢eeflying!我认为超螺旋的转染效率高。 转染前线性化的目的是为了 1）防止随机插入重组时质粒在功能区断开，造成目的基因表达失活，或 2）让同源重组以指定的方式发生Yong wrote: 我认为超螺旋的转染效率高。 转染前线性化的目的是为了 1）防止随机插入重组时质粒在功能区断开，造成目的基因表达失活，或 2）让同源重组以指定的方式发生 我觉得没差别， 但很多书上都说线性化的好， 反正我懒得线性化。Yong wrote: 我认为超螺旋的转染效率高。 转染前线性化的目的是为了 1）防止随机插入重组时质粒在功能区断开，造成目的基因表达失活，或 2）让同源重组以指定的方式发生 就是说,在特定的时候,可以用线性的转染? 可是,我 在做突变盒子的时候(Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit), 盒子说: The parental DNA ,hower, is sensitive to digestion and will be linearized, rendering it at least 100 times less efficient in transformation of bacterial cells. 不知为什么? 其中,载体是我们自己构建的,他提供primer!Frederic wrote: Yong wrote: 我认为超螺旋的转染效率高。 转染前线性化的目的是为了 1）防止随机插入重组时质粒在功能区断开，造成目的基因表达失活，或 2）让同源重组以指定的方式发生 就是说,在特定的时候,可以用线性的转染? 可是,我 在做突变盒子的时候(Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit), 盒子说: The parental DNA ,hower, is sensitive to digestion and will be linearized, rendering it at least 100 times less efficient in transformation of bacterial cells. 不知为什么? 其中,载体是我们自己构建的,他提供primer! 你说的是transformation转化，转化大肠杆菌时又有不同的情况，如果是转化后扩增质粒，肯定不能线性化，如果是转化后与染色体同源重组，很多时候又要求在特定的位点线性化。 我说的是transfection转染，转染哺乳动物细胞时，如果是常规的瞬时表达，无须线性化，如果时染色体整合或同源重组，要看不同的情况决定。 可以肯定的是，无论真核或原核，都存在线性化的情况和不线性化的情况，看具体的实验目的了。